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　　質(zhì)譜的質(zhì)量精度是衡量質(zhì)譜定性能力的一個(gè)重要指標(biāo)，當(dāng)前常見(jiàn)的高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)（TOF、Orbitrap）的質(zhì)量精度為通常在1-5ppm之間，但我們很難通過(guò)測(cè)定的精確質(zhì)量數(shù)得到未知物的唯一分子式，特別是對(duì)于m/z > 400的化合物。

如圖1所示，即使質(zhì)量精度達(dá)到FT-MS的0.1 ppm以內(nèi)，隨著分子量的增大，分子式的可能性越來(lái)越多。因此，僅靠質(zhì)譜的高質(zhì)量精度，往往并不能確定一個(gè)唯一的分子式，尤其是當(dāng)要考慮到更多的元素種類時(shí)。

圖1：不同質(zhì)量精度下的元素組成個(gè)數(shù)

（數(shù)據(jù)來(lái)源：Tobias Kind and Oliver Fiehn, BMC Bioinformatics 2006, 7:234）

質(zhì)譜上測(cè)定一個(gè)化合物時(shí)得到的信息不只是單同位素峰的精確質(zhì)量，還包括了它的重同位素峰及其相對(duì)分布。Tobias Kind和Oliver Fiehn在2006年的文章中已經(jīng)證明了同位素比例結(jié)合精確質(zhì)量數(shù)在減少可能的元素組成方面比單純依靠更高的分辨率和質(zhì)量精度更占優(yōu)勢(shì)。在下文中，我們將在高分辨率(TOF或Orbitrap)和傳統(tǒng)的單或三重四極質(zhì)譜系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，介紹和質(zhì)量精度和同位素譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy）相結(jié)合對(duì)未知物分子式鑒定的作用。

　　四極桿質(zhì)譜上的未知物的分子式測(cè)定

　　在MassWorks軟件中借助TrueCal?校正技術(shù)，可以將四極桿質(zhì)譜的質(zhì)量精度提高100倍以上，將質(zhì)量精度從0.x提升至0.00x的質(zhì)量精度。結(jié)合在校正過(guò)程獲得的無(wú)與倫比的譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy），通過(guò)CLIPS檢索分析，就可以在四極桿GC/MS或LC/MS上來(lái)獲得鑒定未知化合物的分子式的能力。我們對(duì)LC/MS測(cè)定的C25H23N2OS+進(jìn)行了分析，MassWorks軟件測(cè)定的精確質(zhì)量數(shù)m/z = 399.1448，圖2顯示CLIPS檢索分析的條件，設(shè)定可能元素組成為C、H、N、O、S，檢索的質(zhì)量誤差為 ±20mDa。

圖2：CLIPS檢索條件

　　圖3顯示了CLIPS檢索分析的結(jié)果，列表中一共有126個(gè)可能的候選分子式。當(dāng)我們用同位素的譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy）進(jìn)行排序時(shí)，譜圖準(zhǔn)確度≥98.5%的候選分子式只有5個(gè)，正確的分子式C25H23N2OS被準(zhǔn)確地顯示在了列表中的第1位。

圖3：C25H23N2OS的CLIPS分子式檢索結(jié)果（按譜圖準(zhǔn)確度從高至低排序）

正確分子式C25H23N2OS的譜圖準(zhǔn)確度為99.1%，圖4（上）顯示了其理論譜圖和校正譜圖的對(duì)比，兩者完美重合。圖4（下）顯示了排名第1、5、6位分子式的理論譜圖的對(duì)比，可以看到，由于C原子個(gè)數(shù)的不同，在重同位素A+1處，存在明顯的豐度差異，譜圖準(zhǔn)確度越高，分子式正確的可能越高。因此譜圖準(zhǔn)確度是幫我們識(shí)別正確分子式的一個(gè)重要指標(biāo)。

　　圖4：（上）校正譜圖與排序第一的分子式的理論同位素分布比較；（下）排序1、5、6位分子式的理論同位素分布比較

如果只考慮質(zhì)量精度，我們需要達(dá)到多少的精度才能幫助我們?nèi)フ业侥繕?biāo)分子式呢？我們假設(shè)了理論的精確質(zhì)量為實(shí)測(cè)值，重新進(jìn)行了CLIPS分子式檢索，并將分子式的排序設(shè)定為按質(zhì)量誤差排序，結(jié)果見(jiàn)圖5。在得到的119個(gè)待選結(jié)果中，至少需要質(zhì)量精度優(yōu)于1.5ppm才能在前5個(gè)候選分子式中找到正確的分子式。

　　圖5：C25H23N2OS的分子式檢索結(jié)果（按質(zhì)量誤差從小到大排序）

　　高分辨質(zhì)譜TOF的未知物的分子式測(cè)定

　　在MassWorks軟件中通過(guò)sCLIPS檢索分析，可以對(duì)TOF數(shù)據(jù)進(jìn)行全面的峰形校正以獲得高的譜圖準(zhǔn)確度。圖6顯示了C43H74NO15的質(zhì)譜圖校正前后的對(duì)比。

圖6：化合物C43H74NO15的TOF數(shù)據(jù)校正前后的比較

圖7為sCLIPS檢索分析時(shí)設(shè)定的檢索參數(shù)，設(shè)定可能元素組成為C、H、N、O、S，檢索的質(zhì)量誤差為 ±5ppm。

　　圖7：sCLIPS檢索條件

　　圖8顯示了sCLIPS檢索分析的結(jié)果，列表中一共有63個(gè)可能的候選分子式。當(dāng)我們用同位素的譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy）進(jìn)行排序時(shí)，分別只有3個(gè)或2個(gè)候選分子式的譜圖準(zhǔn)確度≥98%或98.5%，正確的分子式C43H74NO15被準(zhǔn)確地顯示在了列表中的第1位。

圖8：C43H74NO15的sCLIPS分子式檢索結(jié)果（按譜圖準(zhǔn)確度從高至低排序）

　　正確分子式C43H74NO15的譜圖準(zhǔn)確度為98.97%，圖9（上）顯示了其理論譜圖和校正譜圖的對(duì)比，兩者完美重合。圖9（下）顯示了排名第1、3、4位分子式的理論譜圖的對(duì)比，可以看出排序第4的分子式的同位素分布的誤差明顯大于前兩個(gè)分子式，因此在實(shí)際的驗(yàn)證分析中，我們只需要考察前三個(gè)分子式。

圖9：（上）校正譜圖與排序第一的分子式的理論同位素分布比較；（下）排序1、3、4位分子式的理論同位素分布比較

　　既然通過(guò)譜圖準(zhǔn)確度能幫我們準(zhǔn)確地將分子式鎖定在前3位，那如果只考慮質(zhì)量精度，我們的TOF需要達(dá)到多少的精度才能幫助我們?nèi)フ业侥繕?biāo)分子式呢？我們假設(shè)了理論的精確質(zhì)量為實(shí)測(cè)值，重新進(jìn)行了sCLIPS分子式檢索，并將分子式的排序設(shè)定為按質(zhì)量誤差排序，結(jié)果見(jiàn)圖10。在得到的候選結(jié)果中，需要具有高于0.2ppm或0.02ppm的非常高的質(zhì)量精度，才能分別在前3個(gè)或前2個(gè)候選元素中找到正確的元素組成。

圖10：C43H74NO15的分子式檢索結(jié)果（按質(zhì)量誤差從小到大排序）

　　 結(jié)論 

　　1）四極桿質(zhì)譜上：[20mDa質(zhì)量精度+98.5%譜圖準(zhǔn)確度精度]=1.5ppm

20mDa (50ppm @ 400Da)的質(zhì)量誤差與98.5%的譜圖準(zhǔn)確度相結(jié)合，通過(guò)TrueCal可以在大多數(shù)單、三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)，等同于1.5ppm的質(zhì)量精度的分子式鑒定效果，且正確的分子式排在前5位，這相當(dāng)于TOF的未知物鑒定水平。

2）高分辨質(zhì)譜上：[5ppm質(zhì)量精度+98.0%譜圖準(zhǔn)確度]=0.2ppm

5ppm的質(zhì)量精度(@845Da)結(jié)合98.0%的譜圖準(zhǔn)確度，可以在高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)等同于0.2ppm質(zhì)量精度的分子式鑒定效果，且正確的元素組成排在前3位。3）在未知物的鑒定分析中，無(wú)需過(guò)分地追求更優(yōu)的質(zhì)量精度，更好的質(zhì)量精度意味著更高的硬件投入成本；而是應(yīng)該考慮質(zhì)量精度+譜圖準(zhǔn)確度的組合，在現(xiàn)有的質(zhì)譜系統(tǒng)上，通過(guò)譜圖準(zhǔn)確度來(lái)提升質(zhì)譜系統(tǒng)的未知物鑒定潛力。如四極桿質(zhì)譜+MassWorks軟件來(lái)達(dá)到TOF的未知物定性效果。

關(guān)于MassWorks

　　軟件MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開(kāi)發(fā)的一款革命性的MS數(shù)據(jù)定性分析軟件，能幫助我們?cè)诘头直媛实乃臉O桿GC/MS、LC/MS直接測(cè)定化合物的精確質(zhì)量，并通過(guò)獨(dú)有的譜圖準(zhǔn)確度概念確定出準(zhǔn)確的分子式。MassWorks軟件同樣適用于高分率質(zhì)譜（TOF、Orbitrap）的定性分析。

　　關(guān)于綠綿科技

綠綿科技是Cerno Bioscience公司在中國(guó)區(qū)的總代理商，負(fù)責(zé)Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等產(chǎn)品市場(chǎng)推廣、銷售、售前/售后技術(shù)支持、應(yīng)用支持。若您想了解獲取 MassWorks 產(chǎn)品的更多信息或應(yīng)用，歡迎致電綠綿科技！