液相色譜常見(jiàn)21個(gè)問(wèn)與答
1. 在不能確定用什么色譜柱合適時(shí), 應(yīng)該先試用哪種柱子?
答：一般來(lái)說(shuō)先試用 C-18 或 ODS 柱(ODS 就是 C18 的意思)。C18 柱適用范圍廣，容易得到良好的分析和分離結(jié)果。而且 C18 柱穩(wěn)定性好，使用壽命長(zhǎng)，性價(jià)比高。
2. HPLC 系統(tǒng)的基本構(gòu)成是什么?
答: 能正常工作的 HPLC 系統(tǒng)必須包括: 進(jìn)樣器、泵、檢測(cè)器、和數(shù)據(jù)處理器(電腦和軟件)。要想得到更好的分析結(jié)果，還可以再加上脫氣機(jī)和柱溫箱。
HPLC 系統(tǒng)的配置方法基本上分兩種：一是將所有的配件整合在一起，另一種是模塊化設(shè)計(jì)，各個(gè)配件模塊可以隨意組合。
（LUMTECH制備液相）
（ECO plus GPC）
3. HPLC 的品牌和型號(hào)眾多, 哪一種適合我呢?
答：雖然儀器指標(biāo)和價(jià)格很重要，但它們并不是的決定因素。許多 HPLC 的使用者覺(jué)得這些指標(biāo)的意義很難理解；有的銷(xiāo)售人員給出的指標(biāo)甚至具有誤導(dǎo)性。因此，您還可以參考考慮以下幾個(gè)因素:
1) 真正儀器用戶的意見(jiàn)；
2) 親手試用儀器或參加儀器實(shí)際演示；
3) 經(jīng)銷(xiāo)商的售后服務(wù)能力；
4) 儀器維護(hù)費(fèi)用；
5) 將來(lái)儀器能否升級(jí)。
4. 進(jìn)樣器有哪些重要指標(biāo)?
答：進(jìn)樣器的重要指標(biāo)包括：重復(fù)進(jìn)樣的重現(xiàn)性、進(jìn)樣范圍以及線性進(jìn)樣范圍、和交叉污染。當(dāng)您只想用 1~2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，或者樣品的濃度范圍很大時(shí)，進(jìn)樣器的線性范圍就顯得尤其重要。進(jìn)樣交叉污染對(duì)痕量分析結(jié)果的可靠性至關(guān)重要；有時(shí)侯甚至需要在每一次進(jìn)樣前后，都運(yùn)行復(fù)雜的清洗程序以克服交叉污染。
手動(dòng)進(jìn)樣閥和自動(dòng)進(jìn)樣器
5. 高壓梯度泵和低壓梯度泵有何不同?
答: 在低壓梯度泵系統(tǒng)中，不同的流動(dòng)相先經(jīng)過(guò)混合閥混合后才進(jìn)入泵頭。低壓梯度泵系統(tǒng)比較經(jīng)濟(jì)，因?yàn)樗挥幸粋€(gè)泵頭。您可以使用多種流動(dòng)相，成本不會(huì)太高。
在高壓梯度泵系統(tǒng)中，不同的流動(dòng)相由不同的泵頭輸送，然后在泵出口處混合。它提供了比低壓梯度泵快得多的梯度, 這是因?yàn)槿軇┑幕旌宵c(diǎn)非常接近柱頭的緣故。
梯度反應(yīng)的快慢可以用滯后體積來(lái)衡量。高壓梯度泵的滯后體積在 50-300 微升之間，而低壓梯度泵的滯后體積可以是前者的 2~3 倍。當(dāng)分析時(shí)間短或者流速很低時(shí)，一個(gè)小的滯后體積是非常重要的。如果滯后體積太大，就無(wú)法得到重現(xiàn)性好的淋洗梯度；因?yàn)樵O(shè)定的梯度尚未到達(dá)柱頭前，分析運(yùn)行已經(jīng)完成。
（Calmflow plus4.1S高壓泵）
（Calmflow plus 6.1L四元泵）
6. 恒流(Isocratic)泵有哪些重要指標(biāo)?
答: 恒流泵的指標(biāo)包括: 大工作壓力、流速范圍、流速的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度、壓力波動(dòng)、壓力監(jiān)測(cè)與過(guò)壓停機(jī)。
（體積很小的恒壓泵）
7. 梯度泵有哪些重要指標(biāo)?
答: 梯度泵的指標(biāo)包括: 大工作壓力、流速范圍、流速的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度、梯度的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度、滯后體積、壓力波動(dòng)、壓力監(jiān)測(cè)與過(guò)壓停機(jī)。
8. 在線脫氣機(jī)是必須的嗎?
答: 永久氣體在不同的溶劑中溶解度不同。當(dāng)不同的溶劑在線混合時(shí)，溶解于原溶劑中的氣體會(huì)因在混合溶劑中的溶解度不同而釋放出來(lái)。作為證明, 您可以做一個(gè)小實(shí)驗(yàn)：加一些水到甲醇中— 您會(huì)看到許多氣泡冒出來(lái)了。如果 HPLC 使用的是低壓梯度泵, 這些氣泡會(huì)影響泵頭的工作和使基線噪音增大,并且導(dǎo)致保留時(shí)間的改變。因此在線脫氣機(jī)是必須的。對(duì)于高壓梯度泵來(lái)說(shuō), 因?yàn)橐后w的混和是在經(jīng)過(guò)泵之后，氣泡的影響要小一些。如果條件允許，還是建議使用在線脫氣, 有助于降低基線噪音。
如果使用的是恒流泵，脫氣機(jī)就不是那么必須了。因?yàn)樵谡婵者^(guò)濾溶劑時(shí)，已經(jīng)將大部分的氣泡除去。
9. HPLC 檢測(cè)器有哪幾種?
答: 現(xiàn)有的檢測(cè)器有： UV 檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器(包括極譜、庫(kù)侖、和安培檢測(cè)器等)、電導(dǎo)檢測(cè)器、示差折射率檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、手性檢測(cè)器、放射性同位素檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器。
10. 如何選擇合適的 HPLC 檢測(cè)器?
答：檢測(cè)器的選擇要依據(jù)分析的對(duì)象和目的來(lái)確定。包括分析物的類(lèi)型與含量、檢測(cè)的靈敏度和選擇性、是否需要化合物分子結(jié)構(gòu)的信息等。
UV 檢測(cè)器是性能可靠和應(yīng)用廣的檢測(cè)器。如果分析物在 200 納米以上有吸收，UV 檢測(cè)器可謂佳之選。而對(duì)于某些大的芳環(huán)類(lèi)化合物 (如多環(huán)芳烴)，選用熒光檢測(cè)器可能將檢測(cè)靈敏度提高 10~100 倍。
電化學(xué)檢測(cè)器用于易發(fā)生電化學(xué)氧化還原反應(yīng)的化合物：例如酚類(lèi)、芳香胺類(lèi)、和一些碳水化合物。因?yàn)檫x擇性強(qiáng)，所以對(duì)上述化合物的檢測(cè)靈敏度要高于UV 檢測(cè)器。但是, 由于電極與柱流出液直接接觸并與其中的化合物發(fā)生反應(yīng),其電化學(xué)響應(yīng)可能不如 UV 檢測(cè)器那樣穩(wěn)定。
電導(dǎo)檢測(cè)器也是一種電化學(xué)檢測(cè)器, 它是離子色譜常用的檢測(cè)器; 主要用于測(cè)定無(wú)機(jī)陰陽(yáng)離子, 和部分極性有機(jī)物 (如一些羧酸) 等。
示差折射率檢測(cè)器可檢測(cè)任何一種化合物, 但是它的靈敏度要比 UV 檢測(cè)器低100 -1000 倍。它的另一個(gè)應(yīng)用限制是不能進(jìn)行梯度淋洗。因此, 示差檢測(cè)器主要用于弱紫外吸收的有機(jī)化合物; 例如小分子有機(jī)酸、碳水化合物、和一些聚合物的檢測(cè)。
蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的應(yīng)用范圍與示差檢測(cè)器相近, 但它可以用于梯度淋洗。它的主要限制因素是需要使用大量的氮?dú)鈦?lái)蒸發(fā)掉流動(dòng)相。
質(zhì)譜檢測(cè)器的應(yīng)用越來(lái)越廣泛, 盡管它的價(jià)格比其它種類(lèi)的檢測(cè)器高 10~20 倍。它是一種兼具高特異性和高靈敏度的通用型檢測(cè)器。與傳統(tǒng)檢測(cè)器相比, 它在定性和定量方面都有很大的優(yōu)點(diǎn)。它不僅能夠給出普通色譜圖, 而且可以提供化合物的分子結(jié)構(gòu)信息。
11. 如何選擇紫外檢測(cè)器的流通池?
答: 如果流通池過(guò)大, 兩個(gè)相鄰的峰有可能在流通池中混合在一起; 如果流通池太小, 到達(dá)光檢測(cè)元件的光太少而可能使噪音過(guò)高。較高的柱前壓也會(huì)限制流速的范圍從而影響流通池的選擇。
我們可以根據(jù)信號(hào)峰的大小來(lái)選擇流通池。 如果峰型狹窄, 需要的流通池就小。一般來(lái)說(shuō), 流通池的體積應(yīng)該不大于峰體積的 1/3。譬如在峰寬是 0.1 分鐘時(shí)的流通池體積：如果流速為 1 毫升/分鐘, 則不應(yīng)該大于 33 微升; 如果流速為0.01 毫升/分鐘則約為 0.3 微升。
12. 如何選擇相似的 C18 柱?
答: 不同廠家提供的 C18 柱或 ODS 柱的 HPLC 譜圖差別可能相當(dāng)大; 其原因是所用硅膠的性質(zhì)、碳覆蓋率和表面積等差別都很大。如果要想在同樣的條件下得到相同的譜圖, 就要用同一廠家的產(chǎn)品。如果想要試用性質(zhì)類(lèi)似的 C18 柱, 可以選擇硅膠的性質(zhì)、碳覆蓋率和表面積都很接近的柱子。
13. 怎樣選擇保護(hù)柱?
答: 保護(hù)柱的體積應(yīng)該小于分析柱的十分; 柱內(nèi)填料也要與分析柱類(lèi)似。如果做不到, 可以選擇保留能力比分析柱弱一些的保護(hù)柱。
14. 色譜柱的重要指標(biāo)有哪些?
答: 這些指標(biāo)包括: 柱效、惰性、重現(xiàn)性、耐用性和 pH 范圍, 以及不同批次的色譜柱之間分析結(jié)果的重現(xiàn)性。
15. 怎樣選擇手性柱?
答: 一對(duì)手性分子能否被某一手性柱分開(kāi)是很難說(shuō)的。因此, 好的方法就是查找文獻(xiàn)看有無(wú)現(xiàn)成的方法, 或者將樣品送到手性柱廠家做試分離。
16. 封尾型反相色譜柱有什么優(yōu)越性?
答: 當(dāng)硅膠表面鍵合了 C18 或者 C8 等基團(tuán)后, 硅膠表面仍然有殘存的硅羥基(SiOH)。這些硅羥基可能同離子型的化合物發(fā)生二級(jí)反應(yīng), 導(dǎo)致峰型不對(duì)稱(chēng)或者拖尾。特別是當(dāng)流動(dòng)相中含有金屬離子, 或者是在分析分離堿性化合物的情況下,二級(jí)反應(yīng)尤為嚴(yán)重。當(dāng)用小分子硅烷將裸露的硅羥基鍵合封尾后, 二級(jí)反應(yīng)即被大大降低。但是, 封端基團(tuán)在酸性的條件下容易水解; 因此, 封尾柱不宜在 pH<3的情況下使用。
17. 怎樣延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命?
答: 流動(dòng)相和樣品應(yīng)事先過(guò)濾; 確認(rèn)流動(dòng)相的 pH 范圍在色譜柱的規(guī)定工作范圍之內(nèi)。如果色譜柱有一段時(shí)間閑置不用, 應(yīng)該用甲醇或乙腈做后清洗。
（LUMTECH新軸向加壓制備色譜柱，通過(guò)可調(diào)整柱端的螺絲進(jìn)行軸向調(diào)整，可以再調(diào)整柱床長(zhǎng)度的30%（25-40mm），保證制備柱性能不變，延長(zhǎng)使用壽命。）
18. 在反相液相色譜中, 為什么乙腈和甲醇是常用的流動(dòng)相?
答：因?yàn)橐译婧图状伎梢院退匀我獗壤旌?。而且在紫外測(cè)定范圍內(nèi)，乙腈的透明度很高；甲醇雖然有吸收，但它是常用的樣品溶劑流動(dòng)相和溶劑一致時(shí)可以減少背景的吸收。此外，它們也容易得到。
19. 用乙腈和甲醇做流動(dòng)相有何不同?
答: 乙腈在近紫外區(qū)(200~210 納米)幾乎沒(méi)有吸收; 如果分析物(如小分子有機(jī)酸)在這一波長(zhǎng)段有吸收的話, 乙腈將是佳的選擇。乙腈也非常適用于高流速或柱子部分堵塞時(shí)的情形, 因?yàn)橛靡译鏁r(shí)的柱壓比用甲醇時(shí)低的多。甲醇大的優(yōu)勢(shì)是價(jià)格低廉; 而且它比乙腈穩(wěn)定。當(dāng)乙腈長(zhǎng)時(shí)間暴露于常見(jiàn)光下時(shí), 有可能形成聚合物并堵塞 HPLC 的閥和過(guò)濾頭。因此, 乙腈好盛放于棕色的玻璃中。
20. 正相 HPLC 和反相 HPLC 有何不同?
答: 在反相 HPLC 系統(tǒng)中, 流動(dòng)相是極性的, 色譜柱填料則是非極性的。所以, 極性強(qiáng)的化合物比極性弱的先被沖洗出色譜柱。而正相 HPLC 的情況則完全相反— 色譜柱填料是極性的, 而流動(dòng)相是低極性的; 弱極性的的化合物較快被洗出。
目前應(yīng)用多的是反相 HPLC, 因?yàn)樗膽?yīng)用范圍廣, 結(jié)果重現(xiàn)性好, 溶劑也容易處理。而正相 HPLC 的保留時(shí)間易改變, 這是由于水分被硅膠填料慢慢吸附所造成的。正相 HPLC 難以做梯度洗脫。但是, 正相 HPLC 在異構(gòu)體和弱極性化合物的分離上效果不錯(cuò), 而這正是反相 HPLC 的弱項(xiàng)。
21. 哪一種參數(shù)能好的反映工作中的 HPLC 的儀器狀態(tài)?
答: 泵壓。它反映了色譜柱和整個(gè) HPLC 系統(tǒng)的狀況。壓力過(guò)低(譬如<10 巴)表明有漏液現(xiàn)象; 壓力過(guò)高說(shuō)明柱子或者管路堵塞。壓力波動(dòng)大(例如從 10 巴到>50 巴), 可能是泵入口處堵塞, 系統(tǒng)內(nèi)有氣泡, 或者進(jìn)樣閥出了故障。要養(yǎng)成隨時(shí)注意泵壓的好習(xí)慣。
（加拿大博朗科技 萬(wàn)海濱
作者從事色譜分析的技術(shù)支持多年，以上是對(duì)于常見(jiàn)問(wèn)題的一個(gè)總結(jié)。希望對(duì)從事色譜分析的同仁能有所幫助。如果您的問(wèn)題在這里沒(méi)有答案，可以給我們發(fā)個(gè)郵件[email protected]。我們會(huì)盡力為您解答。）
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