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前言

　　全柱成像毛細(xì)管等電聚焦(iCIEF)電泳已成為生物制藥領(lǐng)域治療性單克隆抗體(mAb)電荷異質(zhì)性分析的一項(xiàng)重要技術(shù)，無(wú)需傳統(tǒng)CIEF方法的遷移步驟即可通過(guò)紫外實(shí)時(shí)成像的方式完成蛋白分離和定量檢測(cè)。除了電荷異構(gòu)體的定量分析之外，通過(guò)在線(xiàn)電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)的方式直接表征分離的電荷異構(gòu)體對(duì)于研究單克隆抗體的產(chǎn)品質(zhì)量、安全性和有效性至關(guān)重要。iCIEF-MS串聯(lián)技術(shù)將iCIEF的高分離效率與MS的強(qiáng)大的表征能力相結(jié)合，可以對(duì)單克隆抗體的電荷變體進(jìn)行深度表征。

　　<本文節(jié)選并譯自 Schlecht J, Moritz B, Kiessig S, Neusü? C. Characterization of therapeutic mAb charge heterogeneity by iCIEF coupled to mass spectrometry (iCIEF–MS). Electrophoresis. 2022;1–9.>

　　單克隆抗體由于性質(zhì)和制造復(fù)雜，容易出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，特別是電荷異質(zhì)性。單抗的儲(chǔ)存降解也會(huì)產(chǎn)生電荷異質(zhì)性，從而對(duì)結(jié)合效率和治療效果產(chǎn)生潛在的負(fù)面影響。全柱成像毛細(xì)管等電聚焦(iCIEF)技術(shù)在生物制藥領(lǐng)域經(jīng)常被用于電荷異質(zhì)性的測(cè)定，在治療性單抗的開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制中已經(jīng)被公認(rèn)為是一種非?？煽康某Ｒ?guī)方法。

　　iCIEF采用毛細(xì)管全柱成像檢測(cè)(WCID)的方式監(jiān)測(cè)抗體的分離過(guò)程并通過(guò)紫外法對(duì)抗體含量進(jìn)行定量檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)無(wú)需傳統(tǒng)CIEF方法的遷移步驟，在許多情況下已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的CIEF方法而成為生物制藥領(lǐng)域中電荷異質(zhì)性分析的首選方法，因?yàn)樗哂懈鼉?yōu)越的分辨率，沒(méi)有遷移步驟，從而縮短了分析時(shí)間(每個(gè)樣品<15分鐘)，減少了費(fèi)力的樣品制備，以及更快的方法開(kāi)發(fā)時(shí)間。

　　抗體電荷異質(zhì)性的研究除了各電荷異構(gòu)體的分離及定量之外，通過(guò)電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)技術(shù)直接表征分離電荷異構(gòu)體，對(duì)于確保單克隆抗體的產(chǎn)品質(zhì)量、安全性和有效性也至關(guān)重要。

CEInfinite iCIEF分析兼制備型全柱成像毛細(xì)管電泳系統(tǒng)

　　AES公司創(chuàng)新的分析兼制備的CEInfinite 全柱成像iCIEF系統(tǒng)，成功地實(shí)現(xiàn)了iCIEF與ESI-MS串聯(lián)，通過(guò)將iCIEF的高分離效率和UV定量結(jié)果與MS的表征能力相結(jié)合，可以對(duì)單克隆抗體電荷異構(gòu)體進(jìn)行深度表征。只需簡(jiǎn)單的優(yōu)化方法參數(shù)，就能成功地將單抗的各電荷異構(gòu)體峰從iCIEF轉(zhuǎn)移至MS分析。盡管電荷異構(gòu)體峰從iCIEF轉(zhuǎn)移出來(lái)的過(guò)程中會(huì)在一定程度上降低異構(gòu)體峰間的分辨率，但借助高分辨的MS平臺(tái)，即使是從低豐度的電荷異構(gòu)體中分離出完整的單抗電荷異構(gòu)體，包括脫酰胺、糖基化修飾等，都可以被高精度地表征出來(lái)。這就為生物制藥應(yīng)用中的單抗電荷異質(zhì)性表征提供了巨大的潛力。

　　（1）iCIEF-MS串聯(lián)系統(tǒng)的組成

圖1A展示了CEInfinite和Thermo Orbitrap Fusion Lumos 串聯(lián)的示意圖。CEInfinite電泳系統(tǒng)包括一臺(tái)自動(dòng)進(jìn)樣器，一個(gè)用于加壓遷移的蠕動(dòng)泵，以及一個(gè)成像檢測(cè)器(UV)、一個(gè)iCIEF毛細(xì)管卡盒（包含三個(gè)部分：進(jìn)樣毛細(xì)管、分離毛細(xì)管、轉(zhuǎn)移毛細(xì)管）。iCIEF毛細(xì)管卡盒的進(jìn)樣毛細(xì)管端連接到自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)的六通閥接口，轉(zhuǎn)移毛細(xì)管端連接ESI接口。樣品通過(guò)六通閥導(dǎo)入iCIEF毛細(xì)管卡盒的分離毛細(xì)管部分，兩端的電極分別浸入陽(yáng)極液和陰極液液面以下。電極施加高電壓后，抗體在分離毛細(xì)管中完成iCIEF分離，之后由蠕動(dòng)泵提供動(dòng)力，將轉(zhuǎn)移流速控制在10 ~ 80 nl/min(分離毛細(xì)管內(nèi)徑為200μm)，這時(shí)分離毛細(xì)管內(nèi)的電荷異構(gòu)體將依次被轉(zhuǎn)移至ESI源電離并進(jìn)行MS分析。

圖1 (A) CEInfinite iCIEF與ESI-MS串聯(lián)的原理圖，iCIEF系統(tǒng)帶自動(dòng)進(jìn)樣器、注射泵、毛細(xì)管柱，毛細(xì)管柱出口連接ESI接口；(B) 曲妥珠單抗的iCIEF-UV譜圖(濃度2 mg/ml)。聚焦電壓:1500V (1 min)+3000V (10 min)。UV 280 nm 檢測(cè)；(C) Orbitrap Fusion Lumos采集的曲妥珠單抗的總離子流圖（m/z 1500-4000）。

　　（2）iCIEF-MS分析曲妥珠單抗

　　圖2展示了曲妥珠單抗電荷異構(gòu)體的iCIEF-MS分析結(jié)果。從圖2A可看出共有4個(gè)電荷異構(gòu)體的峰被分離并鑒定，包括一個(gè)堿性峰、一個(gè)主峰、兩個(gè)酸性峰。圖2E的主峰解卷積結(jié)果表明，主峰的主糖型(G0F/G0F)的質(zhì)量為148 058.4 Da，與理論質(zhì)量148 057.2 Da相差8 ppm。

　　圖2D的堿性峰解卷積結(jié)果表明，堿性峰也含同樣含有低豐度單糖基G0F、G1F和G2F，其完整分子量相對(duì)主峰差了?19.4 Da，這說(shuō)明是由Asn (?17 Da)或Asp/isoAsp (?18 Da)形成琥珀酰亞胺。圖2F顯示了酸性峰#1解卷積結(jié)果，酸性峰#1的分子量與主峰相差+1.2 Da，酸性峰#2（圖2未展示）的分子量與主峰相差+1.8 Da，這表明它們分別是經(jīng)過(guò)單次脫酰胺修飾和兩次脫酰胺修飾形成。

圖2 iCIEF-MS分析曲妥珠單抗：(A) 曲妥珠單抗TIC-MS，m/ z1500-4000；(B) 主峰質(zhì)譜圖；(C) 主峰質(zhì)譜圖局部放大；(D) 堿性峰解卷積結(jié)果；(E) 主峰解卷積結(jié)果；(F) 酸性峰#1的解卷積譜結(jié)果。

　　（3）iCIEF-MS分析fusion mAb

　　圖3展示了分子量190 KDa的融合單抗的iCIEF-UV和iCIEF-MS分析結(jié)果。我們能清楚地看到UV和MS圖譜中的各個(gè)電荷異構(gòu)體峰能一一對(duì)應(yīng)。這兩個(gè)單抗主峰中含量最豐富的糖基G0F/G0F的分子量測(cè)定精度分別為15ppm(圖3A)和18ppm(圖3B)，SD分別為2 ppm(n=3)和3ppm (n=5)。盡管獲得的質(zhì)量精度較低，但較小的SD值仍能幫助我們可靠地測(cè)定主峰與堿性峰和酸性峰的質(zhì)量差異。圖3A中單抗堿性峰的質(zhì)量與主峰相比差了?19 Da (SD 2 ppm,n=3)，圖3B中的單抗堿性峰的質(zhì)量差了?20 Da (SD 3 ppm,n=5)，表明該分子可能已在肽水平上進(jìn)行了焦谷氨酸修飾(?18 Da)。酸性峰A1、A2、和A3的質(zhì)量增加了6 Da，最有可能是因于脫酰胺形成的不同電荷異構(gòu)體。

圖3 融合抗體的iCIEF-UV和iCIEF-MS分析結(jié)果

　　參考文獻(xiàn)：略

　　原文請(qǐng)參考：Schlecht J, Moritz B, Kiessig S, Neusü? C. Characterization of therapeutic mAb charge heterogeneity by iCIEF coupled to mass spectrometry (iCIEF–MS). Electrophoresis. 2022；1–9.

　　https://doi.org/10.1002/elps.202200170

　　當(dāng)然，如果要進(jìn)行更深度的表征以確定修飾位點(diǎn)和修飾類(lèi)型，僅僅依靠iCEIF-MS獲得的完整分子量信息還不夠，這時(shí)我們可借助CEInfinite的餾分收集功能，對(duì)iCIEF分離的電荷異構(gòu)體餾分收集后進(jìn)行酶解，再使用HPLC-MSMS進(jìn)行肽圖表征。

　　我們?cè)谙乱黄诘膇CIEF的專(zhuān)題中，將為您分享餾分收集功能在電荷異構(gòu)體表征中的應(yīng)用。