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　　近期，在Analytical Chemistry上發(fā)表的一篇文章，為我們展示了一種新的用于抗體藥物電荷異質(zhì)性表征的分析技術(shù)——iCIEF-MS，它不僅能獲得與SCX-MS類似的分析效果，但同時(shí)也表現(xiàn)出了比SCX-MS更為出色的能力，如更好的檢測靈敏度、更佳的重復(fù)性和更低的殘留，這將為蛋白藥物的電荷異質(zhì)性分析提供了一種全新的策略。

　　本文將對文章的部分內(nèi)容進(jìn)行介紹，如有感興趣的讀者，可閱讀原文章以獲取更多內(nèi)容。

　　原文見：Anal. Chem. 2023, 95, 4, 2548–2560

　　蛋白質(zhì)的電荷異質(zhì)性是多種機(jī)制綜合作用的結(jié)果，包括細(xì)胞過程、化學(xué)降解和制 造過程中的生產(chǎn)條件。例如，許多翻譯后修飾(PTMs ) 的發(fā)生，包括 c 端賴氨酸截?cái)?、焦谷氨酸形成、脫酰胺化、唾液化和糖基化可?dǎo)致電荷變異體的形成。在上述修飾中，許多修飾會(huì)引起蛋白質(zhì)等電點(diǎn) (pI) 值的變化，從而對藥物的穩(wěn)定性和溶解度產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，必須強(qiáng)調(diào)需要對電荷變異體進(jìn)行可靠的表征，以評(píng)估關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA)，并確保在整個(gè)臨床和商業(yè)開發(fā)期間治療性mAbs的制造過程中保持一致的質(zhì)量。

　　全柱成像毛細(xì)管等電聚焦 (iCIEF) 和離子交換色譜 (IEX)是治療性mAbs在研發(fā)和質(zhì)量控制中進(jìn)行電荷異質(zhì)性分析的兩種常用技術(shù)。IEX已被開發(fā)為MS檢測的前端分離技術(shù)，在蛋白質(zhì)表征方面有很大的應(yīng)用。然而，iCIEF-MS聯(lián)用技術(shù)在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)電荷變異體方面仍然還存在的關(guān)鍵瓶頸，包括不令人滿意的重復(fù)性、復(fù)雜的操作以及與MS離子源的不兼容。

CEInfinite iCIEF分析兼制備型全柱成像毛細(xì)管電泳系統(tǒng)

　　基于芯片的iCIEF-MS技術(shù)平臺(tái)，使用加拿大AES公司開發(fā)的分析與制備一體的CEInfinte系統(tǒng)用于實(shí)現(xiàn)快速iCIEF分離，后端使用高分辨率的Thermo Q-Exactive Plus質(zhì)譜平臺(tái)進(jìn)行蛋白質(zhì)的電荷變異體的鑒定。iCIEF分離部分采用了與MS兼容的兩性電解質(zhì)、不使用甲基纖維素( MC ) 和尿素的毛細(xì)管柱，通過創(chuàng)新的微升ESI接口提高檢測蛋白質(zhì)藥物電荷變異的靈敏度，這種無縫的MS連接方式使得整個(gè)iCIEF-HRMS分析可以在35 min內(nèi)完成，遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)cIEF-MS，后者通常需要60 min以上。此外，該iCIEF-MS平臺(tái)通過更換μg級(jí)的制備iCIEF毛細(xì)管柱，即可靈活切換到 iCIEF餾分收集模式，對蛋白質(zhì)的電荷變異體組分進(jìn)行組分收集，并進(jìn)行深入的表征，包括LC-MS肽圖分析、生物相互作用等研究。整合 iCIEF-MS 和基于iCIEF 的餾分收集將進(jìn)一步有助于在mAb 電荷異質(zhì)性表征方面建立全面的基于iCIEF 的MS 策略。

圖1 iCIEF-MS的原理圖

　　利用該iCIEF-MS系統(tǒng)，對9種不同的治療性mAb的電荷變異體進(jìn)行表征，并對 iCIEF-MS 的方法進(jìn)行了系統(tǒng)驗(yàn)證。同時(shí)，利用SCX-MS分析了所研究的mAb的電荷異質(zhì)性。兩種手段的分析結(jié)果比較表明，iCIEF在分離分辨率、靈敏度、低殘留效應(yīng)和精確分子量測量精度方面比SCX-MS有明顯優(yōu)勢，盡管SCX-MS的分析通量更高。

表1 九種單抗的等電點(diǎn)信息和使用的iCIEF試劑

　　iCIEF和SCX分離9種單克隆抗體的性能比較

　　在最優(yōu)化的條件下，通過 iCIEF-UV和 SCX-UV 分別分離了9種單克隆抗體，并進(jìn)行了比較。兩種分離工具均在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了高通量分離，所研究的單克隆抗體獲得了相同的峰序列。首先洗脫的是酸性最強(qiáng)的變體，其次是主峰和堿性變體。對于大多數(shù)異質(zhì)性 mAb 混 合物，iCIEF 基于pI差異的分離度顯著高于SCX。在某些情況下，如英夫利西單抗，通過iCIEF可以實(shí)現(xiàn) 4 種電荷變異體和一個(gè)主成分的基線分離，但使用 SCX 的分離度卻不理想。類似地，對于帕博利珠單抗、阿替利珠單抗和地諾單抗，使用iCIEF可以很好地檢測出所有電荷變異體； 然而，在使用SCX時(shí)，一些電荷變體卻丟失了。在分離的選擇性方面，盡管 iCIEF 由于不同的分離機(jī)制而比SCX具有更寬的峰寬，但由于其pI的細(xì)微差異，iCIEF表現(xiàn)出了更好的性能。

圖2 九種mAb的iCIEF-UV圖譜和SCX-UV譜圖

　　iCIEF和SCX 串聯(lián)MS的比較

　　如圖3所示，iCIEF-S和SCX-MS 鑒定了阿替利珠單抗的電荷變異體，并比較了它們的結(jié)果。在SCX分離中，MS檢測到的酸堿峰順序與UV一致。而在iCIEF分離中，堿性峰首先被推向ESI源，因此MS檢測中的酸堿峰順序與UV檢測的順序相反。另一個(gè)顯著的區(qū)別是，由于SCX-MS使用更高的流速，從UV到MS檢測，柱外的峰展寬程度都較輕，這意味著UV峰形狀與MS峰形狀更一致。相比之下，iCIEF-MS 較低的遷移流速意味著柱外效應(yīng)對iCIEF分離的影響更大；從UV 檢測到MS檢測，峰呈現(xiàn)更為明顯的展寬，尤其是主峰，強(qiáng)度更高，并與稍低 pI 的酸性峰部分重疊。這種重疊可以通過使用窄pH的兩性電解質(zhì)和新型的涂層分離毛細(xì)管柱，以進(jìn)一步提高 iCIEF-MS的分離度，以克服峰展寬造成的分辨率損失。

圖3 以阿替利珠單抗為研究對象，比較iCIEF-MS 和 SCX-MS分離效果：UV譜圖(左)和MS-TIC譜圖(右)。

　　iCIEF-MS分析的靈敏度遠(yuǎn)高于SCX-MS

　　在QE Plus上使用SCX -MS方法分析單克隆抗體時(shí)，TIC的響應(yīng)非常低。以阿替利珠單抗為例，即使將100 μg的 mAb 加載到 SCX 柱上，其主成分的 TIC 響應(yīng)為 5 E5，電荷變異體則沒有被檢測到。單克隆抗體在 Orbitrap Exploris 240上的完整質(zhì)量響應(yīng)得到了很大提高。如圖 3 所示，加載 20 μg 阿替利珠單抗后，主成分的TIC 響應(yīng)為 3.82 E8。因此，SCX-MS 對所有單克隆抗體的分析在 Orbitrap Exploris 240 上進(jìn)行，靈敏度更高。

　　與SCX-MS相比，iCIEF-MS 的信號(hào)響應(yīng)更高。雖然 iCIEF-MS的樣品載量只有SCX-MS的十分之一，但iCIEF-QE Plus MS的TIC 強(qiáng)度與SCX -Orbitrap Exploris 240 相同（如圖3所示）。iCIEF-MS比SCX-MS靈敏度高的原因有兩個(gè)。首先，iCIEF-MS所用的流速(小于6 μ L/min)遠(yuǎn)低于SCX-MS所用的流速 (300 μL/ min)。較低的流速導(dǎo)致較高的蒸發(fā)效率和MS效率。iCIEF-MS微流體系統(tǒng)的低流量操作顯著提高了MS靈敏度，并增加了動(dòng)態(tài)范圍，即使樣品量低至1 ng 。其次，文章中用于SCX-MS的洗脫流動(dòng)相的pH接近mAb的pI點(diǎn) (pH 7~10) ，因此洗脫是在中性堿性條件下進(jìn)行的。在iCIEF-MS中，補(bǔ)償液采用含0.5 % FA的50 %乙腈，流速為5 μL/ min，注射泵流速為80 nL/ min。在此比例下，進(jìn)入MS的最終流動(dòng)相處于酸性條件。因此，SCX-MS 中性/堿性流動(dòng)相進(jìn)入MS，而iCIEF-MS是酸性流動(dòng)相進(jìn)入MS，在中性/堿性條件下，蛋白質(zhì)與質(zhì)子結(jié)合的能力比酸性條件下弱得多，因此與iCIEF-MS相比，SCX-MS在較低的電荷狀態(tài)下電荷數(shù)量較少。處于較低電荷態(tài)的蛋白質(zhì)更容易結(jié)合加合物。因此，SCX-MS 洗脫的蛋白質(zhì)比iCIEF-MS洗脫的蛋白質(zhì)有更多的加合物。蛋白質(zhì)的加合物抑制了電離，導(dǎo)致SCX-MS的質(zhì)譜效率低于iCIEF -MS。

圖4 阿替利珠單抗的高靈敏度iCIEF-MS表征分析:不同濃度(0.0 5 ~ 2 mg/mL ) 阿替利珠單抗(A) 的UV譜圖，TIC (B) 和 MS(C )譜均為0.05 mg/mL；電荷變異體的濃度與MS響應(yīng)強(qiáng)度的關(guān)系如圖(D)所示。

　　iCIEF-QE Plus MS 檢測出不同濃度的阿替利珠單抗，見圖4。從酸性變異體和堿性變異體的 TIC和MS譜圖來看，即使在 0.05 mg/ mL的最低濃度 (3倍S/N的UV信號(hào))下，TIC仍然檢測到所有電荷變異體的明顯信號(hào)。而SCX-QE Plus MS不能達(dá)到0.05 mg/ml的檢出限。而在已報(bào)道的傳統(tǒng)cIEF-MS研究中，典型的蛋白質(zhì)分析濃度為 0.1~ 2 mg/mL。

　　iCIEF-MS和SCX-MS的質(zhì)量準(zhǔn)確度比較

　　除靈敏度差異外，iCIEF-MS的質(zhì)量準(zhǔn)確度也優(yōu)于SCX-MS。MS檢測的準(zhǔn)確性取決于MS的分辨率?？蛇_(dá)到的質(zhì)量分辨率不僅取決于儀器的質(zhì)量分辨率極限，而且受到電離過程的嚴(yán)重影響。加合物使離子信號(hào)變寬，因?yàn)樗鼈儾粌H來自于多重質(zhì)子化的分析物，而且來自于攜帶加合物的分析物。因此，更多的加合物導(dǎo)致較差的分辨率和較大的質(zhì)量誤差 (較差的精度) 。雖然源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)裂解(CID) 可以將加合物還原為蛋白質(zhì)，但并不是所有加合物都可以被去除。如表2所示，盡管使用了110 V 的源內(nèi)CID值，但SCX-MS獲得的質(zhì)譜峰仍然比 iCIEF-MS獲得的質(zhì)譜峰寬，導(dǎo)致SCX-MS 主成分MW 偏差 (5.4 ppm )大于iCIEF-MS (2.7 ppm )。另一個(gè)例子是貝伐珠單抗。在沒有脫鹽預(yù)處理的情況下，SCX-MS對貝伐珠單抗的MW偏差高達(dá)33.9 ppm。脫鹽后進(jìn)行分析，貝伐珠單抗的偏差降低到 12.8 ppm。而iCIEF-MS，由于加合離子形成較少，即使不脫鹽， 獲得的貝伐珠單抗的偏差也僅為9.6 ppm。

表2 阿替利珠單抗的電荷變異體的iCIEF-MS和SCX-MS分析結(jié)果比較

　　iCIEF -MS 和SCX-MS 的殘留效應(yīng)

　　iCIEF-MS的殘留效應(yīng)比SCX-MS小得多。阿替利珠單抗在分析后，以水作為空白樣本用于SCX-MS分析，含4% HR 8.5?9.5兩性電解質(zhì)的水溶液作為空白樣本用于iCIEF-MS分析。iCIEF-UV未見明顯信號(hào)，而SCX-UV 在阿替利珠單抗峰值處檢出小信號(hào)。SCX-TIC 和iCIEF-TIC的保留時(shí)間分別為6.82和21.5 min ，信號(hào)峰相對明顯。從這兩個(gè)信號(hào)峰提取的MS。通過去卷積，確定SCX-TIC檢測到的殘余信號(hào)是阿替利珠單抗，而iCIEF-TIC檢測到的信號(hào)只是兩性電解質(zhì)，這意味著iCIEF-MS中沒有檢測到殘余分析信號(hào)。低殘留率使iCIEF-MS對微量蛋白電荷變異體的檢測更加準(zhǔn)確和可靠，避免了假陽性結(jié)果。

圖5 iCIEF-MS和SCX-MS的殘留效應(yīng)的比較：SCX-MS (A-C)顯示殘留阿替利珠單抗信號(hào)，而iCIEF (D-F)沒有殘留分析物信號(hào)。

　　如圖4和圖5所示，觀察到1500~2500 m/z 的背景信號(hào)，MS信息證實(shí)它們不是蛋白質(zhì)，而是來自兩性電解質(zhì)和溶劑背景。背景離子不干擾mAb電荷變異體的鑒定。

　　iCIEF-MS鑒定蛋白質(zhì)的可重復(fù)性

　　iCIEF-MS平臺(tái)的重復(fù)性考察結(jié)果表明，對阿替利珠單抗電荷變異體的測定表現(xiàn)出良好的重復(fù)性。通過iCIEF-MS 進(jìn)行批次間蛋白質(zhì)樣品鑒定，所有批間檢測到的相同電荷變異的質(zhì)量偏差很小 (<10 ppm ) ，可以保證可靠性和一致性。

圖 6 使用阿替利珠單抗進(jìn)行的iCIEF-MS蛋白鑒定的重復(fù)性考察（n=5）

　　9種mAb的iCIEF-MS表征結(jié)果

　　表3列出了所有9種mAb的電荷變異體的修飾鑒定結(jié)果。酸性變異體的表征比堿性變異體更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗嵝宰儺愺w具有更復(fù)雜的修飾。雖然這種酸性修飾通?？梢酝ㄟ^ pI 來區(qū)分，但它們在分子質(zhì)量上的差異相當(dāng)小。iCIEF在線串聯(lián)高分辨率質(zhì)譜可以通過結(jié)合完整的蛋白質(zhì)分子量和測量的pI值來闡明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，為解決酸性電荷變異體的難題提供一個(gè)有用的串聯(lián)平臺(tái)。

表3 九種單克隆抗體的電荷變異體的iCIEF-MS表征結(jié)果

　　使用 iCIEF-MS 和SCX-MS 來表征一系列不同的治療性單克隆抗體的電荷變異體可以獲得類似的結(jié)果。然而，iCIEF-MS 在分離分辨率、靈敏度、低殘留效應(yīng)和MW測量精度方面比SCX-MS 表現(xiàn)出更多的優(yōu)勢。因此，將iCIEF-HRMS分析與更常見的SCX-MS 相結(jié)合，通過正交的驗(yàn)證，可以為分離和鑒別蛋白電荷變異體提供一個(gè)有前景且全面的策略。

　　參考文獻(xiàn)：略

　　原文請參考：GangWu, ChuanfeiYu, WenboWang. Mass Spectrometry-Based Charge Heterogeneity Characterization of The rapeutic mAbs with Imaged Capillary Isoelectric Focusing and Ion-Exchange Chromatography as Separation Techniques . Analytical Chemistry. 2023, 95, 4, 2548–2560..

　　https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c05071

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