国产国语成人毛片高清视频_乱色伦无码视频观看_日韩毛片大全_国产日韩欧美高清_992tv在线无码视频_怡红院最新免费全部视频_日韩美女牲交免费观看视频_美人妻出差被寝取中文字幕_最新热播日韩AV无码精品_一本大道av伊人久久综合蜜芽

　　近期，在Analytical Methods上發(fā)表的一篇文章，介紹了基于成像毛細(xì)管等電聚焦（iCIEF）的餾分收集和在線質(zhì)譜聯(lián)用的分析平臺(tái)來(lái)表征抗體電荷異質(zhì)性?？贵w的電荷變異體經(jīng)過(guò)iCIEF分離后：1）通過(guò)MS直接檢測(cè)分子量；2）通過(guò)組分收集的方式獲取異構(gòu)體的純組分，并用HPLC-MS分析其完整分子量。研究發(fā)現(xiàn)，由于iCIEF-MS的檢測(cè)靈敏度高于HPLC-MS，因此能在mAb的電荷變異體分析中，iCIEF-MS能觀察到HPLC-MS無(wú)法檢測(cè)到的一些低豐度的糖型。這是因?yàn)閕CIEF-MS中使用的流速（小于5 μL/min）遠(yuǎn)低于HPLC-MS中使用的流量（300 μL/min），較低的流速導(dǎo)致在ESI離子化時(shí)產(chǎn)生更高的溶劑蒸發(fā)效率和質(zhì)譜效率。此外，iCIEF分離時(shí)的聚焦預(yù)濃縮也有助于提高靈敏度。

　　本文將對(duì)文章的部分內(nèi)容進(jìn)行介紹，如有感興趣的讀者，可閱讀原文章以獲取更多內(nèi)容。

　　原文見(jiàn)：Anal. Methods, 2023, 15, 411

　　抗體的電荷異質(zhì)性可能由于翻譯后修飾（PTMs）、降解反應(yīng)（如脫酰胺、C-末端賴氨酸加工和糖基化）而產(chǎn)生。電荷變異體的存在可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品功效和藥代動(dòng)力學(xué)改變、產(chǎn)品完全失活，或在最壞情況下增強(qiáng)免疫原性。

　　生物技術(shù)行業(yè)中最常見(jiàn)的電荷變異體檢測(cè)方法包括離子交換色譜法（IEX）、傳統(tǒng)等電聚焦法（IEF）和成像毛細(xì)管等電聚焦（iCIEF）。基于等電點(diǎn)（pI）分離的iCIEF技術(shù)正成為整個(gè)制藥行業(yè)中蛋白質(zhì)電荷異質(zhì)性表征的金標(biāo)準(zhǔn)。此外，后續(xù)的質(zhì)譜（MS）分析將為電荷變異體及其結(jié)構(gòu)提供有力和全面的分析。盡管為此目的使用了不同的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，但大多數(shù)技術(shù)都不能準(zhǔn)確區(qū)分具有微小等電點(diǎn)（pI）差異的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。毛細(xì)管電泳（CE）與質(zhì)譜聯(lián)用一直被認(rèn)為是生物制藥的一種有效的分析策略，包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、cIEF和微流控毛細(xì)管電泳作為分離前端。具體而言，iCIEF和cIEF的快速、高分離分辨率與MS的分子量鑒定相結(jié)合，將為電荷異質(zhì)性提供深度的分析。最近，iCIEF或cIEF已被證明是質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)的一種強(qiáng)大的前端分離工具，但仍需要改進(jìn)以應(yīng)對(duì)更高靈敏度、更高通量和更人性化操作方面的挑戰(zhàn)。

　　至于蛋白質(zhì)電荷變異體的制備，傳統(tǒng)的離線餾分收集技術(shù)，如等電聚焦（IEF）和自由流電泳（FFE），對(duì)于電荷變異體的制備來(lái)說(shuō)，是一個(gè)更加繁瑣的過(guò)程。此外，傳統(tǒng)平板凝膠IEF方法收集的電荷變異體的數(shù)量和純度通常不足以進(jìn)行進(jìn)一步表征。目前，IEX已經(jīng)被用于蛋白質(zhì)電荷變異體的餾分收集。盡管IEX和IEF都是基于電荷的蛋白質(zhì)分離方法，但它們依賴于不同的分離原理，因此，蛋白質(zhì)電荷變異體之間可能沒(méi)有很好的相關(guān)性。由于IEX提供的分離分辨率較低，IEX餾分的純度和鹽含量通常不令人滿意。在傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳（CE）儀器上，傳統(tǒng)CIEF樣品區(qū)帶的分離和收集是不實(shí)用的，并且在商業(yè)上是不可用的。因此，iCIEF分析、iCIEF-MS串聯(lián)技術(shù)、制備iCIEF的餾分收集的集成平臺(tái)成為一種非常理想的方法，可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)藥物的電荷變異體表征能力。

　　在本研究中，使用了加拿大AES公司開(kāi)發(fā)的一種集成的iCIEF平臺(tái)，對(duì)一種治療性單克隆抗體的電荷變異體進(jìn)行表征。使用iCIEF分析模式對(duì)抗體的主成分及其四種電荷變異體進(jìn)行了分析，并當(dāng)完成蛋白質(zhì)在分離毛細(xì)管內(nèi)的聚焦后，以制備模式對(duì)兩種主要的酸性和堿性電荷變異體進(jìn)行餾分收集。收集的電荷變異體餾分在完整蛋白質(zhì)水平上通過(guò)LC-MS進(jìn)行表征，LC-MS的表征結(jié)果與使用iCIEF-MS表征的結(jié)果一致。該平臺(tái)集成的三種iCIEF操作模式的可以通過(guò)更換定制的毛細(xì)管分離柱進(jìn)行快速靈活地切換。蛋白質(zhì)異構(gòu)體表征的整體研究策略是追求分析方法的簡(jiǎn)便性、可靠性、準(zhǔn)確性，而這種集成的分析平臺(tái)將為生物制藥行業(yè)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體表征提供了全面的解決方案。

CEInfinite iCIEF分析兼制備型全柱成像毛細(xì)管電泳系統(tǒng)

　　iCIEF制備與iCIEF-MS

　　AES 公司的iCIEF制備技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高純度、多異構(gòu)體、帶電蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分離、制備和收集，如圖1A所示。蛋白質(zhì)聚焦完成后，用低濃度酸溶液作為遷移溶劑，以100–160 nL/min的流速?gòu)淖⑸浔弥辛鞒?，將聚焦的蛋白質(zhì)區(qū)帶從分離毛細(xì)管中依次推出，觀察到的變異體峰被餾分收集，整個(gè)遷移過(guò)程中需保持高電壓。

　　iCIEF-MS系統(tǒng)采用了與餾分收集相同的壓力遷移技術(shù)，如圖1B所示，iCIEF與MS的連接不需要對(duì)離子源進(jìn)行特殊修改，并且可以直接連接到來(lái)自不同質(zhì)譜品牌的質(zhì)譜儀離子源。在iCIEF分離過(guò)程中，使用的獨(dú)特涂層的毛細(xì)管，使得iCIEF過(guò)程不需要添加聚合物MC和尿素。在50 nL/min流速下的0.1%甲酸遷移溶液和鞘液（水：乙腈=1:1 v/v，含有0.5%v/v甲酸）的作用下，毛細(xì)管中聚焦后的蛋白質(zhì)區(qū)帶被無(wú)縫地引入MS離子源。

　　iCIEF中的餾分收集和在線MS分析模式可以快速靈活地切換，只需更換定制的毛細(xì)管即可實(shí)現(xiàn)，而無(wú)需改變儀器配置。

圖1:（A）iCIEF制備收集和（B）在線iCIEF-MS的原理

　　iCIEF-UV 分析mAb

　　如圖2所示，在iCEIF-UV中使用100μm ID FC涂層毛細(xì)管很好地分離了mAb的主成分、酸性變異體（A1–A2）和堿性變異體（B1–B2）。整個(gè)iCIEF分析時(shí)間不到10分鐘。表1中給出了基于蛋白質(zhì)組分的峰面積和pI的物質(zhì)百分比。蛋白質(zhì)主成分和四種電荷變異體的pI在6.5–8.5 pH范圍內(nèi)，峰面積的重復(fù)性在RSD 5.0%以下（n=6）。觀察到痕量的酸性峰A1和堿性峰B2，其百分比分別為5.4%和2%。酸性A2和堿性B1是主要的電荷變異體，其百分比分別為16.7%和21.0%。

圖2：?jiǎn)慰寺】贵w的iCIEF-UV分析譜圖

表1 iCIEF分析mAb的電荷變異體的pIs和相對(duì)峰面積

　　iCIEF制備用于mAb主成分和電荷變異體的餾分收集

　　在制備型iCIEF上使用320 μm ID的AD涂層毛細(xì)管柱用于分離mAb的主成分和兩種電荷變異體（酸性A2和堿性B1），然后通過(guò)HPLC-MS進(jìn)行完整蛋白質(zhì)分析。如圖3所示，所有預(yù)期的蛋白質(zhì)電荷變異體的峰首先通過(guò)施加高電壓沿著分離毛細(xì)管聚焦，然后由納升注射泵將聚焦的蛋白區(qū)帶遷移到轉(zhuǎn)移毛細(xì)管中，用于組分收集。收集過(guò)程是自動(dòng)化的，通過(guò)連續(xù)運(yùn)行制備，能在三天內(nèi)分離出50-100 mg蛋白質(zhì)。如圖3（左）所示，由納升注射泵驅(qū)動(dòng)的遷移過(guò)程允許蛋白質(zhì)的聚焦區(qū)帶移出分離毛細(xì)管，用于餾分收集。在遷移過(guò)程中，施加高電壓以保持分離分辨率。圖4證明了iCIEF制備對(duì)三個(gè)餾分的優(yōu)異重復(fù)性，這足以確保通過(guò)多次制備獲得足夠多的高純度蛋白電荷變異體組分。使用iCIEF-UV對(duì)收集餾分再次分析，結(jié)果表明三個(gè)餾分中每個(gè)峰的純度都在70.0%以上，收集量在50 mg以上，相應(yīng)的回收率在20-40%之間。在餾分收集之后，對(duì)三個(gè)收集的餾分進(jìn)行HPLC-MS分析以進(jìn)行完整分子量的鑒定（圖6A）。隨后可以通過(guò)LC-MS/MS的深度肽圖譜表征來(lái)進(jìn)行電荷修飾的鑒定，該研究正在進(jìn)行中。

圖3 iCIEF制備收集中的電荷變異體蛋白區(qū)帶遷移過(guò)程

圖4 主成分及其兩種主要電荷變異體的組分收集的重復(fù)性（n=6）

　　iCIEF-MS分析mAb

　　iCIEF-MS系統(tǒng)它允許mAb樣品在完整蛋白水平上快速篩選鑒定電荷變異體，且不需要進(jìn)行餾分收集。iCIEF-MS使分離的蛋白質(zhì)電荷變異體能夠直接注射到高靈敏度MS中，從而保留了前端iCIEF的優(yōu)異分離分辨率。而與MS接口的無(wú)縫連接是基于微流，低流速又能幫助提高質(zhì)譜檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。

　　如圖6B所示，使用窄pH范圍的兩性電解質(zhì)（pH 7-8）和200 μm ID MC涂層毛細(xì)管，在45分鐘內(nèi)通過(guò)iCIEF-MS成功表征了mAb的主成分和四種電荷變異體（兩種酸性和兩種堿性變異體），同時(shí)通過(guò)全柱成像檢測(cè)記錄了其在質(zhì)譜檢測(cè)前的iCIEF-UV圖譜。由于采用了新型的MC涂層分離毛細(xì)管，這種iCIEF-MS在線聯(lián)用策略避免了在樣品緩沖液中使用MC溶液作為添加劑。本研究中建立的iCIEF-MS比報(bào)道的單點(diǎn)檢測(cè)的cIEF-MS結(jié)果顯示出更高的通量，單點(diǎn)檢測(cè)分析時(shí)間超過(guò)1小時(shí)。此外，iCIEF-MS通過(guò)避免常規(guī)cIEF-MS所使用的繁瑣的化學(xué)遷移，大大提高了可重復(fù)性。我們的研究表明，本研究中的iCIEF-MS靈敏度優(yōu)異，尤其是對(duì)微量的變異體A1和B2，如圖6B所示。

圖6：（A）HPLC-MS和（B）iCIEF-MS分析mAb電荷變異體

　　iCIEF-MS與HPLC-MS分析mAb完整分子量的比較

　　主成分和兩種電荷變異體（酸性A2和堿性B1）的MW鑒定利用收集組分的LC-MS分析和在線iCIEF-MS表征進(jìn)行了比較（圖7）。在iCIEF-MS的質(zhì)譜中觀察到了mAb的一些低豐度的糖型，但使用HLPC-MS方法沒(méi)有檢測(cè)到這些糖基化類型。這體現(xiàn)了iCIEF-MS的靈敏度要高于HPLC-MS，因?yàn)閕CIEF-MS中所使用的流速（小于5 μL/min）遠(yuǎn)低于HPLC-MS中使用的流速（300 μL/min）。較低的流速導(dǎo)致更高的溶劑蒸發(fā)效率和質(zhì)譜效率。此外，iCIEF分離中的聚焦預(yù)濃縮也有助于提高靈敏度。這項(xiàng)研究表明，該iCIEF-MS平臺(tái)可以進(jìn)行極其快速的指紋識(shí)別，并為可能識(shí)別靶向電荷變異體提供初步說(shuō)明。收集餾分的LC-MS分析有助于在完整和肽圖水平上進(jìn)行深入表征。

圖7：通過(guò)HPLC-MS對(duì)收集的餾分和在線iCIEF-MS對(duì)電荷變異體（A）主成分（B）酸性A2（C）堿性B1進(jìn)行表征

　　這是首次在一臺(tái)儀器上提供集成iCIEF-UV、餾分收集和iCIEF-MS聯(lián)用的分析平臺(tái)。以前，由于iCIEF中的蛋白質(zhì)峰不能被收集或MS在線檢測(cè)，當(dāng)iCIEF分離完成時(shí)，必須使用傳統(tǒng)的IEX、IEF和FFE來(lái)制備觀察到的蛋白質(zhì)電荷變異體。然而，由于IEX、IEF和FFE與iCIEF技術(shù)的分離機(jī)制和分辨率不同，所收集的餾分通常不能很好地與iCIEF的結(jié)果相匹配，并且由于長(zhǎng)時(shí)間的操作過(guò)程和使用了較強(qiáng)烈的化學(xué)試劑，蛋白在餾分收集過(guò)程中往往會(huì)發(fā)生變性。而在本研究的中建立的制備iCIEF很好地解決了蛋白質(zhì)電荷變異體制備中的這一挑戰(zhàn)。

　　參考文獻(xiàn)：略

　　原文請(qǐng)參考：Teresa Kwok, Mike Zhou, Anna Schaefer. Fractionation and online mass spectrometry based on imaged capillary isoelectric focusing (icIEF) for characterizing charge heterogeneity of therapeutic antibody. Anal. Methods,2023,15,411

　　TEl：010-82676061/2/3/4/5/6/7

　　E-mail: [email protected]

　　全國(guó)服務(wù)電話：400-810-8267

　　聯(lián)系人：李先生 15910254942