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譜圖準(zhǔn)確度分析幫助確定未知物的元素組成和可能的結(jié)構(gòu)

　　在GC/MS的定性分析中，豐富EI碎片離子對于鑒別未知化合物非常有用，特別是當(dāng)化合物已經(jīng)被收錄進NIST或Wiley等譜庫時，我們可以非常方便地通過譜庫檢索來鑒別未知化合物。但如果該化合物沒有被收錄在譜庫中，我們通過使用傳統(tǒng)的單四極桿GC/MS系統(tǒng)，也能夠用分子離子M+和相關(guān)碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)測定來對這些未知化合物進行鑒別。

　　在MS分析中涉及的碎片離子，多年來積累了豐富的知識，McLafferty在權(quán)威論文中系統(tǒng)地總結(jié)了這些知識。在GC/MS分析中遇到的典型的EI碎片離子，如表1所示。NIST譜庫和搜索軟件附帶的MS Interpreter應(yīng)用程序也利用這些碎片離子的知識來進行NIST譜庫檢索，并幫助闡述化合的結(jié)構(gòu)。

　　如表1所示，一些常見的碎片離子有多種可能，如28 Da可能是-C2H4、-CO、-N2中的任意一種，而29Da可能是-C2H5或-CHO等。雖然精確質(zhì)量數(shù)的測定可能有助于區(qū)分這些可能的碎片，但我們想在本文中通過一個真實的例子來證明，在全譜圖校正后，通過在MS的輪廓圖模式中觀察到的譜圖差異，能更好地區(qū)分這些碎片可以，而且是在圖形上更直觀地通過視覺區(qū)分，而不僅僅是單點精確質(zhì)量測定。此外，我們將展示來自同一分子離子(M+)的不同碎片如何在概念上和圖形上通過譜圖準(zhǔn)確度（Spectural Accuracy）的概念聯(lián)系在一起，用于結(jié)構(gòu)說明和元素組成確定。

表1：EI中常見的離子碎片

實驗部分：

　　樣品信息：MS校準(zhǔn)調(diào)諧氣PFTBA （安捷倫GC/MSD自帶），樣品由天然產(chǎn)物制備

　　質(zhì)譜條件：PFTBA和樣品均在MassHunter采集軟件下以Profile模式采集，掃描速度為 2^2 (A/D samples = 4)，質(zhì)量范圍為 m/z 29-600，離子閾值Treshold設(shè)置為零。MS源溫度230℃，四極桿溫度150℃。

　　數(shù)據(jù)分析: MassWorks? V6.0 軟件(Cerno Bioscience公司) 對MS數(shù)據(jù)進行精確質(zhì)量和譜圖準(zhǔn)確度測定。

圖1：通過外標(biāo)法的PFTBA完成MS的精確質(zhì)量和譜圖校正

圖2：經(jīng)MassWorks校正后的樣品數(shù)據(jù)

結(jié)果：

鑒定可能的分子離子(M+)

　　對于圖2中Rt=7.4 min的未知化合物，m/z為168，其精確質(zhì)量為168.1416 Da的離子可能是分子離子(M+)，它將作為本次未知物鑒定的研究對象。使用圖3所示的參數(shù)設(shè)置進行CLIPS檢索會得到一個可能的元素組成的候選列表，如圖4所示。

　　排名第一的分子式(C11H20O+)和第二個分子式(C10H20N2+)的譜圖準(zhǔn)確度均超過99.0%，校準(zhǔn)的MS譜圖與理論MS譜圖之間幾乎完美匹配。第三名的分子式(C9H16N2O+)的譜圖準(zhǔn)確度僅為98.5%，在M+1附近存在明顯的譜圖誤差，更具體地說，與校準(zhǔn)的MS譜圖在M+1附近不擬合，對應(yīng)元素組成中因為少了兩個碳原子使得M+1處的豐度較小。

　　排名第一的分子式到第二的分子式，碳原子數(shù)量減少了一個碳(從C11H20O+的11個C減少到C10H20N2+的10個C)，M+1信號應(yīng)該有明顯的減少。但實際的結(jié)果表明，兩個氮原子以及與之相關(guān)的來自15N的M+1信號的增加在某種程度上彌補了少一個13C的豐度降低，而第一個分子式中存在的一個氧原子由于其缺乏自然的17O同位素因而對M+1信號沒有豐度貢獻(xiàn)。

圖3：MassWorks分析時CLIPS檢索的參數(shù)設(shè)置

圖4：按譜圖準(zhǔn)確度排序產(chǎn)生的候選分子式的CLIPS檢索結(jié)果列表（上圖），第一個候選分子式(中圖)和第三個(底圖)的校正譜圖（紅色）與理論譜圖（藍(lán)色）的疊加

43 Da 碎片丟失的鑒定

　　通過上述對M+ 離子的譜圖準(zhǔn)確度分析，包括各種較高豐度的同位素的分析，將可能的元素組成縮小到前2個候選分子式。

　　其它 EI 碎片離子的存在，包括基峰m/z 125 離子，現(xiàn)在將被用于幫助確定元素組成，并闡明其可能的結(jié)構(gòu)。利用所有可用的 EI 碎片和NIST譜庫，可以輕松地執(zhí)行譜庫檢索，結(jié)果如圖 5 所示。雖然NIST檢索給出的候選結(jié)果第1名確實與圖4中CLIPS檢索的第1名具有相同的元素組成，但其檢索的匹配分值低于800，以及 m/z 125、69、55、41 和 27處的關(guān)鍵碎片上的無法匹配，這表明該化合物可能是NIST譜庫沒有收錄的該分子式的不同同分異構(gòu)體。有趣的是，NIST檢索的所有前10個候選結(jié)果都包含至少一個氧，m/z 125的碎片離子的較高豐度要么與元素組成中的包含的多個氧原子有關(guān)，要么與化學(xué)結(jié)構(gòu)中OH基團中包含的單個氧原子有關(guān)，這是關(guān)于該化合物結(jié)構(gòu)可能范圍的重要線索。

圖5：Rt =7.4 min 峰NIST檢索結(jié)果表明該未知化合物在庫中不存在，最高得分僅為789

　　考慮到M+離子m/z 168和豐度最強的碎片m/z 125的質(zhì)量差為 43 Da，參考表 1 所列的常見碎片，43 Da碎片似乎有兩種可能，CH3CO (含氧)或CH3CH2CH2 (無氧)。CLIPS檢索中可使用的Ion series分析來測量和比較這兩種不同的可能性。

　　未知分子要失去一個CH3CO碎片，首先必須包含至少一個氧原子，這就只剩下CLIPS結(jié)果中第1名的分子式C11H20O+成為可能。通過將從M+離子m/z 168至碎片離子m/z 125這一段的MS譜圖作為一個整體進行譜圖的擬合分析（見圖6），就可以從圖形擬合度上直接測量和評估整體的譜圖準(zhǔn)確度。在整體譜圖準(zhǔn)確度僅為97.0 %的情況下，M+ 的所有同位素都存在顯著而系統(tǒng)的譜圖漂移，丟失碎片CH3CO不太可能。此外，碎片離子m/z 125的“A +1”處可明顯觀察到理論譜圖的豐度要高于實際的校正譜圖，可能說明該理論譜圖的分子式中的碳原子個數(shù)超過了真實的碳數(shù)，這表明丟失的43Da碎片是CH3CH2CH2 的可能性更大。圖7顯示了43 Da碎片丟失為CH3CH2CH2的譜圖擬合結(jié)果，整體的譜圖準(zhǔn)確度為98.1%，M+在m/z 168處沒有出現(xiàn)漂移，碎片離子m/z 125的“A+1”處也擬合完美，這清楚地表明CH3CH2CH2是正確的43 Da碎片丟失。

圖6：丟失CH3CO碎片情形下的校準(zhǔn)譜圖(紅色)和理論譜圖 (藍(lán)色)的擬合比較，譜圖準(zhǔn)確度為97.0%

圖7：丟失CH3CH2CH2碎片情形下的校準(zhǔn)譜圖(紅色)和理論譜圖 (藍(lán)色)的擬合比較，譜圖準(zhǔn)確度為98.1%

氧原子的問題

　　在確認(rèn)43Da碎片丟失為CH3CH2CH2后，CLIPS結(jié)果中的第1和第2個候選分子式，C11H20O+和C10H20N2+，都能產(chǎn)生該碎片，因此還是不能確定二者之中哪一個是正確的元素組成。在m/z 107 Da處的另一個較小碎片離子的存在可能有助于解決這個難題。該碎片與基峰m/z 125的質(zhì)量差為18 Da，它可能是m/z 125進一步的碎片產(chǎn)物。根據(jù)表1中列出的常見片段，18 Da的丟失有一個明確的候選結(jié)果——H2O。圖8顯示了包含碎片CH3CH2CH2和額外的H2O丟失的整體譜圖擬合結(jié)果，包括在更寬的MS范圍(m/z 106~172)中，整體的譜圖準(zhǔn)確度為97.2%。譜圖準(zhǔn)確度偏低的主要是由于在這三個碎片離子之間還存在譜圖干擾，例如，m/z 109, 111和132這三個含量很低的碎片離子并未參與剛才的譜圖擬合建模，因而降低了整體的譜圖準(zhǔn)確度。m/z 109和111處離子的含量較低，猜測可能是由于丟失O和CH2，如圖9所示，驗證了這一假設(shè)，其譜圖準(zhǔn)確度提高到了97.6%。這就表明CLIPS結(jié)果中的排序第一的分子式——C11H20O，它是唯一可行的元素組成，其通過丟失一個氧原子來形成所觀察到的這些碎片離子。

圖8：同時分析丟失一個CH3CH2CH2和一個額外的H2O的情況，校準(zhǔn)譜圖(紅色) 和理論譜圖 (藍(lán)色)擬合的譜圖準(zhǔn)確度為97.2%

圖9：相較于圖8，將m/z 109和m/z 111也加入譜圖的擬合分析，校準(zhǔn)譜圖(紅色) 和理論譜圖 (藍(lán)色)擬合的譜圖準(zhǔn)確度提高至97.6%

其它的小碎片

　　使用相同的方法，可以通過CLIPS的Ion series來特征分析其他較小的碎片或碎片簇，并確定它們各自的元素組成。圖10顯示了從C3至C8一系列的碳?xì)渌槠姆治鼋Y(jié)果。將這些較小的碎片與之前分析過的較大碎片相結(jié)合，有助于拼湊出未知化合物的可能結(jié)構(gòu)。

圖10：當(dāng)使用CLIPS檢索分析m/z 55附近的離子簇時，整體的譜圖準(zhǔn)確度達(dá)到了98.2%，以揭示出該處含有的可能的碳?xì)渌槠?，其他的離子簇也進行了類似的分析，并給出了碎片的結(jié)果

ChemSpider檢索和可能的結(jié)構(gòu)

　　在NIST檢索結(jié)果中找不到合理的碎片離子匹配結(jié)果，而MassWorks軟件的CLIPS檢索結(jié)果已經(jīng)給出了分子離子和碎片離子的可能元素組成，我們借助ChemSpider數(shù)據(jù)庫對可能結(jié)構(gòu)進行檢索(見圖11)，該化合物的可能結(jié)構(gòu)很可能與ChemSpider檢索結(jié)果中的第二個結(jié)構(gòu)非常相似。正確的分子可能是包含一個通過連接到碳上的OH基團的單個氧原子，位于碳?xì)滏湹闹虚g或接近末端，其余的碳?xì)滏湴疃?個碳(最大的碎片為m/z 107，如圖10所示)。

圖11：ChemSpider檢索到的可能的結(jié)構(gòu)

結(jié)論：

　　精確的質(zhì)量測定對于化合物鑒定非常重要，但還不足以幫我們確定出明確的元素組成，而譜圖準(zhǔn)確度已經(jīng)一次又一次地證明，它不僅有助于縮小可能的候選元素組成的數(shù)量，而且有助于理解和提出可能的結(jié)構(gòu)。當(dāng)一個或多個碎片可用時，通過將所有關(guān)鍵碎片納入分析并將它們作為一個整體進行測量和比較各種假設(shè)，以幫助判斷哪種假設(shè)最有可能得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)的支持，并有助于得出關(guān)于鑒別化合物元素組成及其可能結(jié)構(gòu)的合理結(jié)論。即使在NIST等標(biāo)準(zhǔn)譜庫中沒有收錄目標(biāo)化合物，通過將MassWorks軟件中的CLIPS Ion series分析和其他網(wǎng)絡(luò)搜索(如ChemSpider)相結(jié)合，也可以幫助拼湊出未知化合物的可能結(jié)構(gòu)類型，以供進一步研究或考慮。

關(guān)于MassWorks 軟件

　　MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開發(fā)的一款革命性的MS數(shù)據(jù)定性分析軟件，能幫助我們在低分辨率的四極桿GC/MS、LC/MS直接測定化合物的精確質(zhì)量，并通過獨有的譜圖準(zhǔn)確度概念確定出準(zhǔn)確的分子式。MassWorks軟件同樣適用于高分率質(zhì)譜（TOF、Orbitrap）的定性分析。

關(guān)于綠綿科技

　　綠綿科技是Cerno Bioscience公司在中國區(qū)的總代理商，負(fù)責(zé)Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等產(chǎn)品市場推廣、銷售、售前/售后技術(shù)支持、應(yīng)用支持。

　　若您想了解獲取 MassWorks 產(chǎn)品的更多信息或應(yīng)用，歡迎致電綠綿科技！