同位素標記化合物的合成和生產(chǎn)中，很難獲得純品，如氘代、14C、¹⁵N等標記的化合物通常含有一定量的未標記化合物，雖然質(zhì)譜法是檢測和定量標記化合物的最廣泛和最直接的方法，但是標記和未標記的化合物的各種同位素的A和A+1，…，A+n峰的質(zhì)譜峰信號重疊相互重疊，使得尤其是存在多個標記位置的環(huán)或存在Cl、Br元素的化合物，他們的質(zhì)譜信號重疊更為復(fù)雜，即使是使用高分辨率的質(zhì)譜系統(tǒng)（如TOF、Orbitrap）也難以準確解決定量的問題。

盡管一些文獻報道中提出了各種質(zhì)譜信號的重疊校正方案，但即使在50%（50﹕50）高濃度的標記與未標記混合物，其校正誤差也大于±10%，這使得對5-10%的低濃度的混合物的可靠定量幾乎不可能實現(xiàn)的。

通過MassWorks的TrueCal^TM技術(shù)對測量的質(zhì)譜信號峰進行峰形校正，來提高質(zhì)譜系統(tǒng)對同位素峰型的譜圖準確度（Spectral Accuracy），以確保使用多元最小二乘法擬合能從校準的質(zhì)譜圖中計算出每個同位素峰的“真實”貢獻。

考察兩種同位素峰分布復(fù)雜度不同的化合物：第一種是含有一個Cl原子的D2標記化合物——Hydrochlorothiazide-3,3-d2 (HCT-d2)，第二種是含有兩個Cl原子且¹⁴C 標記在苯環(huán)上的化合物——雙氯酚酸鈉。選擇了三種質(zhì)譜系統(tǒng)來評儀器定量分析同位素標記物的的適用性：ThermoFisher LTQ/Orbitrap、Agilent LC/MSD和WatersXevo TQ LC/MSMS。 在每個MS系統(tǒng)上，首先在Profile模式下測量純的未標記化合物，然后將其進行峰形校正，以評估可實現(xiàn)的譜圖準確度。 再利用譜圖準確度，對同位素標記的兩種化合物進行計算來獲得它們中含有的各種標記和未標記離子的相對濃度。

D2標記含Cl化合物——HCT-d2

未標記的HCT（C7H6N3O4S2Cl）在LTQ/Orbitrap下采集的Profile模式數(shù)據(jù)，使用MassWorks處理，獲得的譜圖準確度約為97.3%（見圖1），標記后的HCT-d2的譜圖準確度又有明顯下降，僅為96.2%，將D2標記和未標記的HCT按50%：50%混合后的譜圖準確度下降更為嚴重，只能達到92.5%（見圖2），導(dǎo)致的結(jié)果就是MassWorks給出的兩者的相對濃度出現(xiàn)了±10%的誤差，這種誤差下要準確計算標記和未標記的含量顯然是不可能的。

圖1 MassWorks軟件在LTQ/Orbitrap下測定的HCT（C7H6N3O4S2Cl）的同位素譜圖準確度

圖2 MassWorks軟件在LTQ/Orbitrap下測定的HCT-d2（C7H4N3O4S2ClD2）的同位素譜圖準確度

將測試轉(zhuǎn)移到單四極桿的Agilent LC/MSD系統(tǒng)上，測得的未標記的HCT的譜圖準確度高達99.0%，標記的HCT-d2的譜圖準確度為98.9%，50%：50%混合物的譜圖準確度為98.7%（見圖3），結(jié)果表明，單四極桿的LC/MSD的同位素譜圖準確度測定準確。然后進一步考察HCT和HCT-d2按不同比例混合的MassWokrs定量測試效果，每一個濃度測定3次，然后數(shù)據(jù)對比實際的混合濃度和MassWorks軟件計算出來濃度值，結(jié)果見圖4，結(jié)果表明，平均濃度誤差反映了測量偏差或系統(tǒng)偏差均小于0.6%，且要小于標準偏差（SD＜1%）。HCT-d2的實際混合濃度值與軟件計算值的線性相關(guān)系數(shù)R²=0.9996，預(yù)測的標準誤差SEP=0.53%。

圖3 未標記的HCT（上）、標記的HCT-d2（中）、HCT/HCT-d2= 50:50的混合物（下），紅色曲線為校正的同位素譜圖，黑色為理論的同位素譜圖

圖4 使用MassWorks的分析得到的不同濃度HCT的定量分析結(jié)果

圖5 HCT-d2的計算濃度與實際濃度的線性關(guān)系

¹⁴C標記含Cl化合物——HCT-d2

雙氯芬酸鈉(C14H10NO2Cl2Na)，含有2個Cl原子，苯環(huán)上可被標記的¹⁴C的數(shù)量為0~6個，¹⁴C標記后的化合物的同位素峰分布比HCT-d2更為復(fù)雜，使用LTQ/Orbitrap應(yīng)對7種潛在共存混合物的準確定量任務(wù)來說是一個挑戰(zhàn)。然而，當(dāng)用Waters Xevo TQ LC/MSMS測量時，從供應(yīng)商購買的放射性的¹⁴C標記化合物的譜圖準確度達到了98.9%（見圖6），MassWorks軟件計算出來的0~6個¹⁴C標記化合物的各自的濃度比（圖7），計算出來的總的放射性比活性為62.6%，這與供應(yīng)商提供的62.7 mCi/mmol值非常一致。圖8為按不同比例混合的標記和未標記化合物的定量分析結(jié)果，標記物的混合濃度值與軟件計算濃度值的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9989，預(yù)測的標準誤差SEP=1.98%。

圖6 未標記雙氯酚酸鈉（上）和標記的雙氯酚酸鈉（下）的譜圖準確度結(jié)果

圖7 MassWorks給出的標記的雙氯酚酸鈉的校正質(zhì)譜圖及其中所有化合物的相對含量

圖8 使用MassWorks的多元線性分析得到的不同濃度雙氯芬酸鈉的定量分析結(jié)果

圖9 雙氯芬酸鈉14C標記物的計算濃度與實際濃度的線性關(guān)系

關(guān)于MassWorks 軟件

MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開發(fā)的一款革命性的MS數(shù)據(jù)定性分析軟件，能幫助我們在低分辨率的四極桿GC/MS、LC/MS直接測定化合物的精確質(zhì)量，并通過獨有的譜圖準確度概念確定出準確的分子式。MassWorks軟件同樣適用于高分率質(zhì)譜（TOF、Orbitrap）的定性分析。

關(guān)于綠綿科技

綠綿科技是Cerno Bioscience公司在中國區(qū)的總代理商，負責(zé)Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等產(chǎn)品市場推廣、銷售、售前/售后技術(shù)支持、應(yīng)用支持。

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