質(zhì)譜同位素輪廓分布信息幫助確定化合物的分子式
質(zhì)譜法是鑒定未知化合物的重要手段。在有譜庫輔助的前提下，我們可以通過譜庫檢索來快速確定目標(biāo)物可能的幾個(gè)疑似候選物，然后在標(biāo)準(zhǔn)品對照的情況下，通過保留時(shí)間信息、質(zhì)譜圖來對疑似物進(jìn)行驗(yàn)證以確定真正的目標(biāo)。在沒有譜庫時(shí)，就需要測定目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量數(shù)，然后對可能的分子式進(jìn)行預(yù)測（見圖1），再通過二級或多級質(zhì)譜的碎片信息來探索可能的結(jié)構(gòu)。
圖1： 精確質(zhì)量數(shù)推導(dǎo)可能的元素組成（分子式）
雖然高分辨質(zhì)譜在高質(zhì)量精度下已經(jīng)將精確質(zhì)量數(shù)測定得盡可能準(zhǔn)確，但是還是不足以幫助我們解決分子式的鑒定問題。因?yàn)楫?dāng)未知化合物的分子量很大時(shí)，匹配在測定精確質(zhì)量誤差范圍內(nèi)的可能元素組成數(shù)量也會增加；盡管高分辨質(zhì)譜擁有極高的質(zhì)量精度，但是仍然會存在很多不能排除的可能元素組成。Tobias Kind和Oliver Fiehn在2006年發(fā)表的一篇文章中，總結(jié)了在僅考慮C、H、N、O、S五種元素的情況，不同分子量大小的化合物在不同質(zhì)量精度下的可能元素組成的個(gè)數(shù)，如圖2所示，即使質(zhì)量精度達(dá)到FT-MS的0.1 ppm以內(nèi)，隨著分子量的增大，元素組成的可能性越來越多。因此，僅靠質(zhì)譜的高質(zhì)量精度，往往并不能確定一個(gè)唯一的元素組成，尤其是當(dāng)要考慮到更多的元素時(shí)。
圖2： 不同質(zhì)量精度下的元素組成個(gè)數(shù)
（數(shù)據(jù)來源：Tobias Kind and Oliver Fiehn, BMC Bioinformatics 2006, 7:234）
高分辨質(zhì)譜上的同位素信息與分子式鑒定
質(zhì)譜圖上的信息，除了質(zhì)量數(shù)外，還有同位素的豐度信息。Tobias Kind和Oliver Fiehn在2006年的文章中還證明了同位素比例結(jié)合精確質(zhì)量數(shù)在減少可能的元素組成方面比單純依靠更高的分辨率和質(zhì)量精度更占優(yōu)勢。圖3顯示了C25H23N2OS+在0.1ppm質(zhì)量精度下，共有7個(gè)可能的分子式，排除掉2個(gè)Na元素個(gè)數(shù)不對的分子式，仍然有5個(gè)分子式，對比這5個(gè)分子式的理論同位素輪廓分布，我們可以看到它們同位素輪廓分布存在顯著差異（見圖4），因此只要將理論的同位素輪廓與測試譜圖的同位素輪廓進(jìn)行比對，就能確定出真正的分子式。
圖3：FT-MS在0.1ppm質(zhì)量精度下得到的C25H23N2OS+可能分子式
?。〝?shù)據(jù)來源：Yongdong Wang and Ming Gu. Anal. Chem. 2010, 82, 7055–7062）
圖4：五個(gè)候選分子式在A+1處的理論同位素輪廓分布（MS分辨率=80萬）
?。〝?shù)據(jù)來源：Yongdong Wang and Ming Gu. Anal. Chem. 2010, 82, 7055–7062）
但實(shí)際的質(zhì)譜譜圖由于儀器本身等因素的影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)譜圖的峰型發(fā)生了變形，從而會使得同位素輪廓的比對會產(chǎn)生5%以上的譜圖誤差，這對于區(qū)分一些同位素豐度比差異接近的分子式并不容易。在MassWorks軟件中，不只是簡單地將實(shí)驗(yàn)譜圖和理論譜圖進(jìn)行對比，而是用獨(dú)特的峰形校正技術(shù)去除噪音等畸變因素，以得到跟理論譜圖一樣的對稱分布的輪廓曲線。用這種校正譜圖跟理論譜圖做對比，可以將同位素分布的譜圖誤差縮小至2%以內(nèi)，進(jìn)一步提升利用同位素輪廓區(qū)分分子式差異的準(zhǔn)確度。如圖5所示，m/z=844.5067的化合物在TOF儀器上，在4ppp的質(zhì)量精度下共有75個(gè)可能的分子式，盡管排名第一的分子式的質(zhì)量誤差并不是最小的，但是它的校正譜圖和理論譜圖的同位素譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy）最佳，證明了該分子式為正確的分子式；而排名第2的分子式可以明顯觀察到由于S元素的影響使得理論譜圖比樣品的校正譜圖在A+2處的豐度要高，譜圖的誤差為2.6%左右。
John C. L. Erve在2009年和2011年發(fā)表的文章中，分別驗(yàn)證了在LTQ/Orbitrap和Q-TOF上利用MassWorks的峰形校正技術(shù)確定分子式的優(yōu)越性，尤其是在Orbitrap上，分子量大于900的化合物，譜圖準(zhǔn)確度可以幫助消除99%以上的分子式。
圖5：TOF在4ppm誤差內(nèi)，Top 2分子式的理論譜圖和校正譜圖的譜圖準(zhǔn)確度對比
高分辨質(zhì)譜可以通過精確質(zhì)量數(shù)據(jù)和同位素分布信息來確定未知化合物的分子式，那么低分辨質(zhì)譜，如四極桿質(zhì)譜，是不是也可以這樣做呢？
可以！
四極桿質(zhì)譜上的分子式測定
MassWorks軟件的TrueCal?校正技術(shù)可以將四極桿質(zhì)譜的質(zhì)量精度提高100倍以上，從而使其獲得精確質(zhì)量數(shù)的測定能力，再借助CLIPs技術(shù)就能準(zhǔn)確測定未知化合物的元素組成，這一技術(shù)已經(jīng)在數(shù)千個(gè)客戶處得到了驗(yàn)證。
四極桿質(zhì)譜的分辨率盡管不如高分辨質(zhì)譜，但是它測定同位素豐度的穩(wěn)定性是優(yōu)于高分辨質(zhì)譜的，而且更寬的線性范圍，可以保證高、低豐度的同位素都能被準(zhǔn)確檢測。圖4中的高度分離的不同元素的同位素，在四極桿質(zhì)譜上表現(xiàn)為這幾個(gè)元素的疊加，我們依然能清晰的區(qū)分出這5個(gè)分子式的同位素輪廓分布的差異，因此，在四極桿質(zhì)譜上通過精確質(zhì)量數(shù)結(jié)合同位素分布一樣能鑒定出未知物的分子式。
圖6：五個(gè)候選分子式在四極桿質(zhì)譜上的理論同位素輪廓分布（MS分辨率=800）
?。〝?shù)據(jù)來源：Yongdong Wang and Ming Gu. Anal. Chem. 2010, 82, 7055–7062）
圖7（上）顯示GC/MS測定的m/z=164的化合物，在10mDa的誤差內(nèi)，共有6個(gè)分子式，但它們的同位素分布的譜圖準(zhǔn)確度存在明顯差異，圖7（下）清晰顯示了前3個(gè)分子式的理論同位素與實(shí)測校正譜圖的對比，結(jié)果表明正確的分子式即為第一個(gè)分子式C10H12O2。
圖7：GC/MS上測定精確質(zhì)量數(shù)和分子式
（數(shù)據(jù)來源：Wei Zhou and Yaheng Zhang,Rapid Commun. Mass Spectrom. 2011, 25, 3097–3102）
關(guān)于MassWorks 軟件
MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開發(fā)的一款革命性的MS數(shù)據(jù)定性分析軟件，能幫助我們在低分辨率的四極桿GC/MS、LC/MS直接測定化合物的精確質(zhì)量，并通過獨(dú)有的譜圖準(zhǔn)確度概念確定出準(zhǔn)確的分子式。MassWorks軟件同樣適用于高分率質(zhì)譜（TOF、Orbitrap）的定性分析。
關(guān)于綠綿科技
綠綿科技是Cerno Bioscience公司在中國區(qū)的總代理商，負(fù)責(zé)Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等產(chǎn)品市場推廣、銷售、售前/售后技術(shù)支持、應(yīng)用支持。
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